活菌數(shù)檢測方法詳解：新型活菌計數(shù)法的優(yōu)缺點

活菌數(shù)檢測方法主要包括以下幾種：平板計數(shù)法，稀釋涂片法和熒光染色法。其中平板計數(shù)法適用于細菌的計數(shù)，而稀釋涂片法則適用于真菌的計數(shù)；熒光染色法則可以對活菌進行直接的染色，從而進行計數(shù)。每種方法都有一定的優(yōu)點和缺點，需要根據(jù)具體需求選擇合適的方法。

一、基于平板培養(yǎng)的活菌計數(shù)法

• 平板菌落計數(shù)法
  • 操作過程：將待測樣品經(jīng)一系列10倍稀釋，選擇三個稀釋度的菌液，分別取0.2ml放入無菌平皿，再倒入適量已熔化并冷至45℃左右的培養(yǎng)基，與菌液混勻，冷卻、待凝固后，放入適宜溫度的培養(yǎng)箱或溫室培養(yǎng)，長出菌落后計數(shù)。也可將稀釋的菌液取0.2ml加到已制備好的平板上，然后用無菌涂棒將菌液涂布整個平板表面，放入適宜溫度下培養(yǎng)，計算菌落數(shù)。按公式“每毫升原菌液活菌數(shù) = 同一稀釋度三個以上重復(fù)平皿菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×5”計算原菌液的含菌數(shù)。這種方法能測出樣品中微量的菌數(shù)，是教學(xué)、科研和生產(chǎn)上常用的一種測定細菌數(shù)的有效方法，可用于土壤、水、牛奶、食品和其他材料中所含細菌、酵母、芽孢與孢子等的數(shù)量測定，但不適于測定樣品中絲狀體微生物，例如放線菌或絲狀真菌或絲狀藍細菌等的營養(yǎng)體等。操作不熟練可能造成污染，或培養(yǎng)基溫度過高損傷細胞等原因會造成結(jié)果不穩(wěn)定。
• 稀釋涂布平板法
  • 操作過程：倒平板（將肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加熱溶化，待冷至55 - 60℃，高氏Ⅰ號瓊脂培養(yǎng)基加入10%酚數(shù)滴，馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基加入鏈霉素溶液），然后進行樣品的倍比稀釋，將定量的稀釋液進行平板培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù)算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此方法廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細菌檢驗，是最常用的活菌計數(shù)法。如果發(fā)現(xiàn)有雜菌，需要再次進行分離、純化，直到獲得純培養(yǎng)。

二、其他傳統(tǒng)活菌計數(shù)法

• 計數(shù)器測定法（血細胞計數(shù)器計數(shù)法）
  • 操作過程：取一定體積的樣品細胞懸液置于血細胞計數(shù)器的計數(shù)室內(nèi)，用顯微鏡觀看計數(shù)。由于計數(shù)室的容積是固定的，因而依據(jù)計數(shù)器刻度內(nèi)的細菌數(shù)，可計算樣品中的含菌數(shù)。該方法簡便易行，可立即得出結(jié)果，不僅適于細菌計數(shù)，也適用于酵母菌及霉菌孢子計數(shù)。
• 電子計數(shù)器計數(shù)法
  • 工作原理：測定小孔中液體的電阻變化，小孔僅能通過一個細胞，當一個細胞通過這個小孔時，電阻明顯增加，形成一個脈沖，自動記錄在電子記錄裝置上。該法測定結(jié)果較準確，但它只識別顆粒大小，而不能區(qū)分是否為細菌，所以要求菌懸液中不含任何碎片。
• 比濁法
  • 原理：細菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比，與光密度成正比，所以可用光電比色計測定菌液，用光密度（OD值）表示樣品菌液濃度。
  • 特點：簡便快捷，但只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數(shù)目，對顏色太深的樣品，不能用此法測定。另外，實驗測量時一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準確。
• 測定細胞重量法
  • 濕重法：單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進行稱重。
  • 干重法：單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后，以清水洗凈放入干燥器加熱烘干，使之失去水分然后稱重。此法適于菌體濃度較高的樣品，是測定絲狀真菌生長量的一種常用方法。
• 測定細胞總氮量或總碳量法
  • 原理：氮、碳是細胞的主要成分，含量較穩(wěn)定，測定氮、碳的含量可以推知細胞的質(zhì)量。這種方法適于細胞濃度較高的樣品。
• 顏色轉(zhuǎn)變單位法（CCU法）
  • 適用對象：通常用于很小，用一般的比濁法無法計數(shù)的微生物，比如支原體等。
  • 原理：以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標，來計數(shù)微生物的相對含量。例如解脲脲原體的操作，需取12只無菌試管等一系列操作來計數(shù)。

三、新型活菌計數(shù)法

• 基于基因表達活性的qPCR法（定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法）
  • 操作過程：信使RNA（mRNA）首先通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成互補DNA（cDNA），隨后，以cDNA為模板進行qPCR反應(yīng)?？梢赃x取微生物特定基因的mRNA作為檢測靶標，對樣品中的活菌數(shù)目進行測定。
  • 特點：具有靈敏度高、特異性強、快速的優(yōu)勢；但樣品制備過程中的微小變化，都會影響最終的測定結(jié)果，對實驗環(huán)境和操作人員的要求較高。同時，還需要根據(jù)不同的微生物，制定不同的檢測靶標和對應(yīng)標準。
• 流式細胞分選技術(shù)
  • 原理：在染色或熒光標記的基礎(chǔ)上，可以使用流式細胞分選技術(shù)對細菌進行計數(shù)。此技術(shù)已成為生命科學(xué)領(lǐng)域的常見實驗手段之一。
• 拉曼光譜檢測方法
  • 原理：基于拉曼光譜效應(yīng)（入射光照射在介質(zhì)上時，與介質(zhì)的分子或原子發(fā)生了能量交換，散射出來的光與入射光的振動頻率不同），可從分子水平上，精確反映樣品的化學(xué)成分組成和分子結(jié)構(gòu)差異。表面增強拉曼光譜技術(shù)、共聚焦顯微拉曼光譜技術(shù)的出現(xiàn)，使得其在分析鑒定過程中，更加直觀、易于觀察和控制，并且結(jié)果更加顯著。不過該技術(shù)還在研究之中，目前仍有一些問題需要克服，有許多研究人員正在積極克服這些局限性，有望成為替代培養(yǎng)法的新一代活菌數(shù)檢測方法。
• 基于細菌產(chǎn)物檢測的方法
  • 原理：益生菌在生長和發(fā)酵過程中，可能會分泌一些物質(zhì)或放出一些氣體，在這些生物標記物的基礎(chǔ)上，可以通過檢測活菌產(chǎn)生的分泌物或氣體的量，間接確定活菌的數(shù)目。這種新型的檢測方法想象空間巨大，但目前仍然很不成熟，并且利用生物標記物區(qū)分死活菌的標準仍不全面。

活菌計數(shù)法的誤差來源

活菌計數(shù)法在食品檢測中的應(yīng)用

新型活菌計數(shù)法的優(yōu)缺點比較

活菌計數(shù)法的未來發(fā)展趨勢