ELISA檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體流程，elisa檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體的常見(jiàn)問(wèn)題

摘要：本文介紹了一種使用ELISA檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體的流程。從樣本中提取DNA或RNA，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因。將PCR產(chǎn)物連接到載體上，并通過(guò)酶切和連接反應(yīng)進(jìn)行純化。將純化后的載體與特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，并通過(guò)ELISA方法檢測(cè)其活性。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于鞭毛蟲(chóng)的快速診斷和研究。

ELISA檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體的一般流程

1. 樣本采集與處理
   • 血清：采集血液，待血液凝集（至少半個(gè)小時(shí)）后取血清。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將血清放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。在使用前需確保血清沒(méi)有沉淀，若有沉淀應(yīng)再次離心。
   • 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10 - 20分鐘后，離心20分鐘左右（2000 - 3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。不能檢測(cè)含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的活性。
   • 尿液：用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000 - 3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行。
   • 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000 - 3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2 - 7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右，通過(guò)反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份，保存過(guò)程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。
   • 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2 - 8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，分裝后一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 板包被
   • 將檢測(cè)的一個(gè)成分與包被板結(jié)合，通常是通過(guò)被動(dòng)吸附完成。如果是用于抗體檢測(cè)，像ELISA間接法那樣使用純化抗原，或像ELISA夾心法那樣使用捕獲抗體，來(lái)制備具有選擇性的包被板。包被板的類型大多數(shù)是聚苯C2H4或聚苯C2H4衍生物，其具有不同的結(jié)合特性，這取決于目標(biāo)物質(zhì)和檢測(cè)的性質(zhì)。一些目標(biāo)物質(zhì)，包括重度糖基化的蛋白質(zhì)、碳水化合物、DNA、脂類、短肽和有洗滌劑的蛋白質(zhì)，是不能很好吸附的。
3. 孵育
   • 將試劑加入ELISA板后，進(jìn)行孵育，以便有時(shí)間進(jìn)行結(jié)合或反應(yīng)。每次孵育的溫度和時(shí)間將取決于檢測(cè)步驟和正在進(jìn)行的操作，通常在樣品應(yīng)用之后，于37℃下孵育1小時(shí)。
4. 洗滌
   • 在應(yīng)用檢測(cè)每個(gè)組成部分之間，直到結(jié)果測(cè)定前都要進(jìn)行洗板。溶液從孔中排空后，通常使用磷酸鹽緩沖鹽水 - 20（PBST）做為緩沖液清洗孔，以去除任何殘留的未結(jié)合抗原、抗體或試劑?？梢杂枚嗤ǖ酪埔浩魇止ね瓿?，或使用自動(dòng)洗板機(jī)。不充分的清洗可能會(huì)導(dǎo)致高背景信號(hào)，而過(guò)多的清洗會(huì)導(dǎo)致樣品信號(hào)低，不一致的清洗可能會(huì)導(dǎo)致整個(gè)板塊的不一致，從而導(dǎo)致不可靠的結(jié)果。
5. 阻斷
   • 在用蛋白質(zhì)包被ELISA板后，阻斷通常是必要的，以防止在接下來(lái)方案步驟中測(cè)定抗體的任何非特異性結(jié)合。與檢測(cè)無(wú)關(guān)的混合蛋白被添加到板中并進(jìn)行孵育，占據(jù)任何可用的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。常見(jiàn)的蛋白質(zhì)阻斷緩沖液選擇包括脫脂干乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。另外，非離子洗滌劑，如Tween20或TritonX - 100，可作為阻斷劑使用，但不能像蛋白質(zhì)那樣提供永久性阻斷。
6. 抗體加入
   • 選擇正確的抗體至關(guān)重要，單克隆抗體和多克隆抗體都可以使用，它們都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)。單克隆抗體提供高特異性，但成本較高。使用采用二級(jí)抗體的方法增加了額外的步驟，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間，增加了出錯(cuò)機(jī)會(huì)，需要多優(yōu)化來(lái)找到合適的兼容抗體對(duì)。然而，使用多克隆二級(jí)抗體所帶來(lái)的靈敏度提高可能使其成為一種值得或必須的有效檢測(cè)方法發(fā)展方向。
7. 測(cè)定
   • 常見(jiàn)的是利用酶介導(dǎo)的可見(jiàn)顏色變化化學(xué)反應(yīng)，然后可以用紫外 - 可見(jiàn)分光光度法測(cè)量，根據(jù)顏色變化或吸光度值來(lái)判定結(jié)果。

ELISA檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體的靈敏度

ELISA檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體的特異性

ELISA檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體的常見(jiàn)問(wèn)題

ELISA檢測(cè)鞭毛蟲(chóng)抗體的注意事項(xiàng)